【东东工艺指南】高收率质粒制备工艺，加速基因治疗规模化生产

　　引言

　　基因治疗作为下一代生物医药的核心方向，在遗传病、肿瘤、罕见病等领域展现出巨大潜力。质粒DNA是病毒载体生产的关键起始物料，其质量与规模直接决定了基因治疗产品的开发效率与成本。随着全球基因治疗临床试验数量逐年攀升，市场对高质量、高纯度、规模化GMP级别质粒的需求急剧增长。目前国内质粒产能仍处于建设初期，整体供应链尚未成熟，且国产质粒在超螺旋比例、工艺稳定性等方面与国际水平仍有差距。面对未来几年内基因治疗从研发走向产业化的发展趋势，建立自主可控、具备成本优势的质粒生产平台，将成为推动中国基因治疗领域实现商业化闭环的关键环节。

　　质粒生产面临的挑战

　　国际品牌已在质粒生产工具与GMP级别原料领域形成垄断，其层析介质与过滤膜包价格高昂，导致质粒生产成本居高不下。国内企业虽在培养基、一次性反应袋等环节逐步实现国产替代，但在高载量纯化填料、大规模切向流过滤系统等核心工艺装备方面仍依赖进口。随着基因治疗逐步推进至商业化阶段，如何构建具有自主知识产权、高回收率、高线性放大能力的质粒纯化平台，并进一步降低生产成本、提升质粒产能与质量稳定性，已成为国内企业参与全球竞争必须突破的产业瓶颈。

　　基因治疗质粒制备工艺流程

　　东富龙（300171）提供从培养基、一次性组件、层析填料到过滤系统的基因治疗全流程国产化解决方案，凭借自主可控的供应链与规模化生产能力，东富龙能为客户显著降低生产成本并保障稳定供应，助力本土生物制药企业突破工艺瓶颈、加速产业化进程。

　　图1. 质粒制备工艺流程

　　质粒培养案例

　　本案例分别采用Tofflon Ecoil CDM01微生物培养基、商业化CD培养基对Stbl3进行培养，数据显示Stbl3菌株生长水平：0D600与进口商业化CD培养基的菌株生长曲线基本一致；24小时发酵终点，Tofflon Ecoil CDM01的质粒产量质粒产量可达52.58μg/mL，具有明显优势。 （Ecoil培养基在质粒培养上的核心优势可在往期推文回顾：Tobitec Ecoli CD培养基——国内首款专为mRNA药物设计）

　　图2. 大肠杆菌生长曲线

　　图3. 24小时质粒产量

　　质粒纯化案例

　　质粒裂解液澄清

　　本案例分别采用Tofflon SaiClear S32、Tofflon SaiClear S15和PolySai 0.1μm + SaiClear S15深层过滤器组合，过滤190L质粒碱裂解收获液，实验数据显示最优选择为PolySai 0.1μm + SaiClear S15深层过滤器组合，过滤1小时后滤液浊度从116NTU降至2NTU以下，最终载量达到430L/m ， 通过UV法（检测蛋白）计算，最终产物收率达到 76.7%，高效去除了裂解液中的固体杂质，获得高澄清度的滤液，同时保证较高的目标产物收率。

　　图4. 质粒澄清压力和载量关系图

　　图5. 质粒澄清浊度和载量关系图

　　质粒层析纯化

　　东富龙采用经典三步法进行质粒层析纯化，图表数据显示：亲和纯化步骤中，Tofflon Rigose PlasmidPure在保持高纯度的同时，收率也有显著优势。同时，东富龙层析介质内毒素控制水平均达到行业严格要求（≤10 E.U./mg pDNA），且在最终精纯步骤（AEX）后可进一步降低至1-5 E.U./mg pDNA的低水平，为质粒DNA的规模化、低成本、高质量生产提供了可靠的国产化纯化解决方案。（东富龙经典三步法与两步法对比的质粒层析案例可在往期推文回顾：质粒纯化工艺大比拼）

　　表1. 东富龙三步法质粒层析收率与纯度表

　　质粒浓缩换液

　　本案例采用Tofflon TanFlux Ⅱ RC 100KD 2.5m 超滤膜包，对200L料液进行23倍超滤浓缩和5倍透析，整个工艺在温和的跨膜压（10psi）下进行， 并且处理通量始终稳定在40-60LMH。浓缩换液处理前超螺旋Sc%83.1% ，处理后超螺旋Sc%82.8%，出色地保持了质粒超螺旋结构的稳定性，同时具备处理快速（工艺时间<2h）和过程稳定的优点，为工业化生产高质量质粒DNA提供了可靠且可放大的纯化方案。

　　图6. TanFlux Ⅱ RC 100KD 2.5m 质粒浓缩换液案例